La rosuvastatina 136

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La rosuvastatina reduce la formación de neoíntima en un modelo de rata de lesión con el balón Procesos resumen de antecedentes de la reestenosis, a raíz de una lesión arterial, son compleja que involucra diferentes tipos de células que producen diversas citoquinas y enzimas. Entre esas enzimas, se cree que las metaloproteinasas de músculo liso derivadas de las células de la matriz (MMP) para participar en la migración celular, la degradación de la matriz extracelular, y la formación de neoíntima. MMP-9, también conocida como gelatinasa B, se expresa inmediatamente después de la lesión vascular y de su expresión y la actividad puede ser inhibida por las estatinas. Utilizando un sistema establecido en modelo in vivo de la lesión vascular, se investigó el efecto de la rosuvastatina inhibidor de la reductasa HMG-CoA en MMP-9 expresión y la formación de neoíntima. Materiales y métodos 14 semanas de edad ratas Sprague Dawley macho se sometieron a lesión por balón de la arteria carótida común. La mitad de los animales recibieron rosuvastatina (20 mg / kg de peso corporal / día) a través de una sonda oral, comenzando 3 días antes de la lesión. la actividad de gelatinasa y la formación de neoíntima se analizaron 3 días y 14 días después de la lesión con balón, respectivamente. 14 días después de la lesión vascular, la actividad proliferativa se evaluó por tinción de Ki67. Resultados Después de 14 días, los animales en el grupo de rosuvastatina mostraron una disminución en la formación total de neoíntima (0,194 a 0,01 mm 2 frente al 0,124 0,02 mm 2. p 0,05). lesión con el balón dio lugar a una mayor actividad de MMP-9 3 días después de la intervención, tanto para los animales tratados con rosuvastatina y los controles con ninguna diferencia significativa entre los grupos. Hubo una tendencia hacia una reducción en el número de células Ki67 positivas 14 días después de la lesión. Conclusiones La rosuvastatina atenúa la formación de neoíntima sin afectar principios de la actividad de MMP-9 en un modelo de rata de lesión vascular. Introducción arterial restenosis después de la angioplastia con balón sigue siendo una limitación clínico común incluso después de la implantación del stent 1. Este efecto se debe principalmente a la formación de neoíntima acelerado debido a la migración de células del músculo liso y la proliferación después de la lesión endotelial 2. se han discutido varios mecanismos fisiopatológicos. Algunos estudios sugieren profusa cicatrización de la herida vascular debido a las células endoteliales adyacentes y progenitores endoteliales 3. 4. Otros han demostrado una TGF - mecanismo dependiente de la remodelación arterial constrictiva y la formación de engrosamiento de la íntima compuesta de células del músculo liso 5. En parte, la remodelación vascular también es inducida por la liberación de las enzimas de degradación de la matriz SMC, tales como metaloproteinasas de la matriz y los inhibidores tisulares de las metaloproteinasas de la matriz (TIMP) 6. 7. En particular, MMP9 está regulada positivamente tras la lesión del vaso 8. La inhibición de las MMP por resultado una disminución proliferación de SMC y la inhibición de la hiperplasia neointimal 9. 10. Puesto que se sabe que (HMG-CoA) reductasa hidroximetilglutaril coenzima A son beneficiosos en la prevención primaria y secundaria de la enfermedad cardiovascular, y que sus efectos pleiotrópicos son independientes de su potencial de reducción de lípidos, algunos estudios se han centrado en el efecto de la terapia con estatinas en la prevención de la reestenosis 11 17. Varios in vitro e in vivo demostraron la reducción de la MMP-9 expresión después del tratamiento con estatinas 19. 20. Recientemente, se ha demostrado que el potente inhibidor de la HMG-CoA reductasa rosuvastatina inhibidor reduce la formación de neoíntima en un modelo de rata hipertensiva 16. Además promueve rosuvastatina de médula ósea dependiente de re-endotelización y reduce la formación de neoíntima en ratones 21. Nuestro estudio evaluó el efecto de la rosuvastatina en MMP-9 expresión y la formación de neoíntima en un modelo de rata de lesión vascular. Materiales y métodos Animales y tratamiento farmacológico Veintidós ratas Sprague Dawley macho (380 - 420 g Charles River Laboratories, Sulzfeld, Alemania) a la edad de 14 semanas se mantuvieron dentro de las instalaciones de cuidado de animales de la Universidad de Heidelberg. Los animales recibieron agua y comida gratis (dieta estándar Chow) ad libitum en una habitación de temperatura controlada con un ciclo de 12 horas de luz / oscuridad. Los animales se dividieron al azar en tratados rosuvastatina grupo y los controles. Desde tres días antes de la lesión con balón, la mitad de las ratas recibieron rosuvastatina (20 mg / kg de peso corporal / día) a través de una sonda oral. Un número de las ratas fueron sacrificados 3 días después de la lesión con balón para inmunotransferencia y el ensayo gelatinolytic. Para la evaluación de la formación de neoíntima, las ratas adicionales se sometieron a eutanasia 14 días después de la lesión. Alojamiento y cuidado de los animales, y los procedimientos llevados a cabo en este estudio se realizaron de acuerdo con las directrices y regulaciones compuestas por el Comité de Cuidado de Animales de la Universidad de Heidelberg. Las ratas lesión por balón se anestesiaron mediante inyección intraperitoneal de ketamina (100 mg / kg de peso corporal) y xilazina (15 mg / kg de peso corporal). Tras la incisión de la línea media del cuello, la arteria carótida externa izquierda se expuso y un catéter de balón 2F (Baxter Healthcare) se introdujo hasta la salida aórtica de la arteria carótida común. A continuación, el balón se infló con solución salina hasta que se sintió una ligera resistencia. Mientras gira, el globo se retiró a través de la arteria carótida común de desnudar el endotelio. Este procedimiento se repitió dos veces. Posteriormente, se retiró el catéter, la arteria carótida externa se liga y la herida se cerró. arterias derechas contralaterales sirvieron como controles no lesionados. Tres y 14 días después de la cirugía las ratas se anestesiaron como se describió anteriormente, se recogió sangre de la vena cava inferior, almacenarse para su uso posterior, y los animales fueron sacrificados por desangrado. Las ratas fueron perfundidos con 20 ml de solución salina tamponada con fosfato a presión fisiológica a través del ventrículo izquierdo. Izquierda y se extirparon las arterias carótida común derecha, se eliminó el tejido conjuntivo adherido y se almacenó a -80ºC. Determinación de los niveles de lípidos en plasma de colesterol total en suero, lipoproteínas de alta densidad (HDL) y colesterol de lipoproteínas de baja densidad (LDL) se determinaron enzimáticamente en el plasma heparinizado. El análisis morfométrico de la formación de neoíntima / inmunohistoquímica arterias carótidas comunes fueron varias secciones consecutivas (5 m) y se tiñeron con hematoxilina-eosina (HE). Las secciones fueron evaluados a ciegas usando morfometría asistida por ordenador (Olympus Mikroskopie Hamburgo, Alemania e Imagen Pro, Media Cybernetics, Silver Spring, EE. UU.). El tamaño de la capa neo-íntima se determinó como el área entre la lámina elástica interna y la circunferencia luminal (datos expresados ​​en mm 2). Además, se evaluó el número total de células contando núcleos. Además, las relaciones de neoíntima / media se calcularon mediante un observador ciego. Para determinar la proliferación y la integridad endotelial, de serie de secciones se tiñeron para Ki67 con un anticuerpo policlonal de conejo (Abcam, Cambridge, Reino Unido), un conejo de von Willebrand factor de anticuerpo (Dako, Carinteria, CA, EE. UU.) y una actina de músculo - smooth conjugado directamente FITC anticuerpos (Sigma-Aldrich, St. Luis MO, EE. UU.). el índice de proliferación se calculó como el número de células Ki67 positivas / cantidad total de células. La extracción de proteínas de transferencia de Western y ensayo de gelatinolytic Para el ensayo gelatinolytic, arterias congelados se homogeneizaron con tampón de lisis (50 mmol / l Tris-HCL, pH 7,6 150 mmol / l de NaCl 5 mmol / l de CaCl2 0,05 Brij-35 0 , 02 NaN3 1 Triton X-100). Los lisados ​​se cizalladas por la interrupción de ultrasonidos, y se centrifugaron a 14.000 r. p.m a 4ºC durante 10 min. Los sobrenadantes se utilizaron como lisados ​​de células enteras y se determinó la concentración de proteínas utilizando el método de Bradford (ensayo de proteínas Bio-Rad). ensayo Gelatinolytic g proteína Ten se utilizaron para analizar la actividad de la gelatinasa tejido del vaso. Se detectó actividad de gelatinasa en un gel de gelatina 10 (Invitrogen, Carlsbad, EE. UU.), utilizando tampón de SDS (todos los productos químicos Invitrogen, Carlsbad, EE. UU.). Después de la electroforesis, los geles se incubaron con tampón de renaturalización zymogram durante 30 minutos y se desarrollaron en un tampón de desarrollo de zymogram durante 12 horas. Los geles se tiñeron con azul de Coomassie 0,125 R-250 durante 30 minutos en 10 ácido acético y 50 metanol. Finalmente, los geles se destiñeron con una solución que contiene 10 ácido acético y metanol hasta 10 bandas claras de gelatinolysis aparecieron en un fondo azul oscuro. El peso molecular de las bandas gelatinolíticas se estimó por comparación con marcadores de peso molecular preteñidos (Bio-Rad, Munich, Alemania). Los geles fueron secados y analizados por densitometría. Western Blot Diez g de proteína estaban separadas por 10 SDS-PAGE gel (Invitrogen, Carlsbad, EE. UU.) y se transfirió a membranas de nitrocelulosa (Schleicher und Schuell, Alemania). Después del bloqueo (5 sin grasa leche en polvo disuelto en TBST) la membrana se incubó con el anticuerpo primario (policlonal de cabra contra la MMP-9 rata, dilución 1: 2000) durante la noche a 4ºC, se lavaron tres veces con TBST, seguido de incubación con un anticuerpo secundario para 1 hora a temperatura ambiente. Después del lavado, las bandas se visualizaron con ECL (Amersham Biosience, EE. UU.), grabado en Hyperfilm (Amersham) y se cuantificaron por densitometría (Bio-Rad). Los anticuerpos, utilizados en este estudio, se adquirieron de Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, EE. UU.. Análisis estadístico Todos los datos se expresaron como media SEM o como media SD, como se indica. Las diferencias significativas entre las medias en los perfiles de lípidos en plasma se determinaron con los estudiantes no pareados de dos colas t-test, las diferencias en el tamaño de la neoíntima utilizando el test U de Mann-Whitney. Un valor de p de 0,05 fue considerado estadísticamente significativo. Resultados Efecto sobre los niveles de lípidos del plasma en el momento de la eutanasia, los animales no mostraron diferencias significativas en colesterol total, HDL y LDL colesterol. Además, no hubo diferencias en el peso corporal (Tabla 1). El peso corporal y el perfil lipídico No hubo diferencias significativas en los niveles de colesterol total, HDL y LDL, así como se pudo detectar el peso corporal. El análisis morfométrico En comparación con los controles, el tratamiento con rosuvastatina plomo a una disminución de la zona de neoíntima (0.194 0,01 mm 2 frente a 0,124 0,02 mm 2. p 0,01). formación Neonintima de la arteria carótida común (tinción de hematoxilina / eosina) 14 días después de la lesión por balón en un animal de control (A) y un animal tratado con rosuvastatina. (B) El tratamiento con rosuvastatina conduce a una reducción del tamaño de la neoíntima, así como una reducción de la relación neoíntima / media. (DISCOS COMPACTOS). se utilizó proliferación / integridad de la capa endotelial Ki67 tinción para determinar la proliferación. Hubo una tendencia hacia una reducción en el número de células Ki67 positivas en los animales tratados con rosuvastatina (2,1 0,17 frente a 1,6 0,13 p 0,058). Sin embargo, la diferencia no alcanzó significación estadística (Figura 2AB). las células Ki67 positivas (flechas) dentro de la neoíntima a los 14 días después de la lesión de un animal control. tratamiento (A) La rosuvastatina tendió a reducir el índice de proliferación dentro de la neoíntima (número de células Ki67 positivas / cantidad total de células). Sin embargo, a día 14 ninguna diferencia significativa se pudo detectar (p 0,058). (B) La tinción con anticuerpo inmunofluorescencia marcado contra el factor de von Willebrand (anticuerpo secundario Alexa 594 en rojo) y - smooth actina de músculo en FITC (verde) demostró que reendotheliazation no se completó 14 días después de la lesión (cabeza de flecha) (-smooth actina de músculo en FITC, verde). Una arteria adventicia se muestra como un control positivo (flecha). (C) Barra de Escala 100 m. Dos semanas después de la lesión, las arterias todavía mostraron incompleta re-endotelización, según se evaluó por tinción con una inmunofluorescencia-anticuerpo contra el factor de von Willebrand y - smooth actina de músculo. No hay diferencias significativas entre los grupos de tratamiento podría ser detectado (datos no mostrados, la Figura 2C). lesión de la actividad del globo gelatinolytic de las arterias de ratas aumentó la expresión de una banda de 92 kDa en la zimografía de gelatina 3 días después de la lesión. No se pudo detectar señal en los vasos contralaterales no denudadas (derecha CCA), lo que sugiere que estas proteínas 92-kD son inducidos por lesión. Esta banda corresponde a una forma de rata 95-kD colagenasa tipo IV / gelatinasa (MMP-9) 21. Sin embargo se pudo detectar ninguna diferencia entre rosuvastatina tratado y de control de ratas (3,754 1,074 frente a 3,488 1,816 Figura 3A). Ensayo de actividad gelatinolytic demostró una inducción de 92-kDa gelatinasa B tres días después de la lesión con balón, en la rata arteria carótida común. No hay diferencia entre rosuvastatina tratados y los controles se pudo detectar (A). Western blot confirmó la expresión de MMP-9 en las arterias carótidas de rata común tres días después de la lesión con balón. No expresión significativa se pudo detectar en las arterias contralaterales no lesionados, que sirvieron como controles (B). MMP-9 expresión de la proteína de transferencia Western en CCA se determinó mediante Western blot en ratas tratadas y los controles de rosuvastatina. lesión por balón dio como resultado una inducción de la MMP-9 expresión en las arterias 3 días después de la de-endotelización. vasos contralaterales en las mismas ratas no mostraron inducción de MMP-9. Una vez más, no hubo diferencia significativa entre rosuvastatina tratado y de control de los animales (Figura 3B). Discusión intervenciones coronarias percutáneas (PCI) son ampliamente utilizados para el tratamiento de la enfermedad coronaria. Sin embargo, el beneficio a largo plazo es a menudo limitada por la reestenosis, que ocurre en aproximadamente 30 de los pacientes tras la implantación del stent de metal desnudo 23. Introducción de los stents liberadores de fármacos se ha reducido la incidencia de reestenosis significativa, pero está asociado con varios problemas tales como la trombosis del stent 24. los procesos de remodelación de la matriz extracelular por las MMP son esenciales para la formación de neoíntima en la reestenosis postangioplastia, así como en la vena aortocoronario vasculopatía del injerto 8. 25. inhibidores de la HMG-CoA reductasa son conocidos para suprimir la expresión de MMP-y por lo tanto son una opción de tratamiento potencial en la prevención de la reestenosis 19. 20. 26. El uso de un modelo animal estándar de la lesión vascular hemos sido capaces de demostrar una reducción significativa de la formación de neoíntima en ratas tratadas con rosuvastatina. Estos datos están de acuerdo con otros estudios en ratas y ratones, mientras que Kappert et al. (2006) sólo se observó un aumento en la circunferencia luminal pero no hubo diferencias en el tamaño total de neoíntima, ni en íntima / relación de los medios de comunicación 16. 17. 26. Prevención de la restenosis por inhibidores de la HMG-CoA reductasa puede ser dependiente de la dosis. Kappert et al. (2006) utilizaron la rosuvastatina en una dosis de tan sólo 1 mg / kg / d, mientras que nosotros y van de Harst (2006) administrado rosuvastatina en una dosis de 20 mg / kg / d, una dosis previamente demostrado para inhibir hepática de HMG-CoA por 90 en ratas 16 18. Se ha demostrado que la lesión vascular hace que la regulación positiva temprana de la metaloproteinasa de matriz 2 (MMP-2, gelatinasa A) y matrixmetalloproteinase-9 (MMP-9, gelatinasa B) y por lo tanto puede desempeñar un papel importante en la migración de SMC 8. Usando desendotelialización globo, un método eficaz para causar daño vascular severa, que mostró que la actividad gelatinasa B se reguló 3 días después de la intervención. Sin embargo, el tratamiento con rosuvastatina tuvo ningún efecto sobre la expresión o actividad de la gelatinasa B gelatinolytic después de la lesión con balón. Por lo tanto, la prevención de la reestenosis por rosuvastatina debe actuar a través de un mecanismo de MMP-independiente. En consonancia con otros estudios, encontramos células Ki67 positivas dentro de la neoíntima de todos los animales 14 días después de la lesión. Hubo una tendencia hacia la reducción de la expresión en el grupo de tratados con rosuvastatina, en comparación con los controles. La proliferación después de la lesión arterial es comúnmente descrito como un evento temprano que alcanza un máximo dentro de la capa íntima entre cuatro y siete día y 27. Es posible que la tendencia observada en nuestro estudio se alcanzó significación estadística en un punto de tiempo anterior, tal como se evaluó en el presente estudio. Otros estudios también demostraron una fuerte asociación entre la lesión arterial grave con una interrupción de la lámina elástica interna (IEL) y la expresión de Ki67. Por lo tanto, la variabilidad en la severidad de la lesión entre los diferentes estudios también puede contribuir a las diferencias en la evolución temporal de la proliferación 28. En concordancia con otros estudios, las células en proliferación son casi encuentran exclusivamente en la superficie luminal. Los datos recientemente publicados demostraron efectos antiproliferativos de rosuvastatina en un modelo ex vivo de la lesión con el balón a través de tipo uroquinasa receptor del activador del plasminógeno (uPAR) 29. Además, los datos adquiridos por nuestro grupo y otros mostraron efectos inhibidores de las estatinas sobre la actividad de los factores de transcripción Egr-1, NF-kappaB, y AP-1 30. 31. Las células adyacentes de la pared vascular intacta son los principales responsables de la reparación de heridas después de la lesión 3. Datos recientes apoyan la posibilidad de que las células derivadas de médula ósea, que circulan en la corriente de la sangre contribuyen a la neoangiogénesis y aceleraron la reendotelización que conduce a una reducción de la formación de neoíntima 32. 33. Werner et al. (2002) demostraron los efectos beneficiosos de las células progenitoras endoteliales en un modelo de ratón de lesión de carótida: tratamiento con rosuvastatina aceleró re-endotelización y redujo significativamente la formación de neoíntima 21. Sin embargo, no queda claro si esto se debe a un efecto directo de la terapia con estatinas o debido a un aumento de estatinas mediada en el número de células endoteliales circulantes, inmaduras, 34. Se ha observado una falta de re-endotelización a los 14 días después de la lesión que no fue afectada por el tratamiento con estatinas. Las diferencias en la recuperación endotelial entre los estudios se pueden explicar por distancias variables entre endotelio no traumatizados y áreas denudadas, ya que la regeneración, al menos en parte, parte de la capa endotelial no lesionados adyacente 35. Se ha informado de que incluso tan tarde como seis semanas después de la lesión, algunas áreas de la arteria todavía permanecieron sin endotelio 36. Los nuevos datos, además, han demostrado una asociación entre el tratamiento con estatinas y la reducción del riesgo de trombosis venosa que implica un efecto de la inhibición de la HMG-CoA y el sistema de coagulación 31. 32. Los estudios demostraron una inhibición inducida por estatinas del factor tisular procoagulatorios y la actividad del factor tisular incluso propuesto como un predictor de riesgo de reestenosis tras ICP e implante de stent 37 40. Los estudios clínicos han sugerido que la disminución de lípidos por las estatinas protege de la restenosis después de stent coronario 41. 42. Se ha demostrado que la rosuvastatina disminuyó significativamente LDL, el colesterol y los niveles de glycer IDE tri y que el tratamiento de rosuvastatina de alta dosis fue más eficaz que dosis similares de atorvastatina en la reducción del colesterol LDL directo 43. En contraste, nuestro modelo, en el momento de la necropsia, no mostró diferencias en el colesterol total, LDL, HDL o entre los grupos que también confirma un efecto colesterol-independiente sobre la formación de neoíntima en nuestra vivo-modelo. La falta de un efecto reductor del colesterol del tratamiento con estatinas en los roedores se ha investigado en varios estudios y parece ser muy común, incluso a dosis más altas 44. 45. Los mecanismos de cómo el tratamiento con estatinas de apoE - / - ratones, incluso provoca un aumento en el colesterol sérico, como se ha observado en algunos estudios, todavía no está claro 46. Una posible explicación es que la administración continua de las estatinas a través de Chow incluso estimula la expresión y / o actividad de la HMG-Co A reductasa en el hígado de ratones tratados. En conclusión, nuestro estudio demuestra que la rosuvastatina inhibe la formación de neoíntima tras lesión con el balón y es compatible con la hipótesis de que este efecto es independiente MMP9. Notas Mi Bendición y R Kranzhfer contribuyeron igualmente a este trabajo. declaraciones